Методы и подходы изучения биоразнообразия протистов

2015-10-14

Для изучения биоразнообразия протистов необходимо применение комплекса классических и современных методов цитологии, молекулярной-биологии, филогенетики, биогеографии, статистики, а также информатики и web-дизайна.
1) Методы цитологии.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
- При работе с коллекцией живых культур протистов ИБВВ РАН будут использованы оригинальные, разработанные нами методы выделения и долгосрочного содержания клональных культур протистов с использованием видеозаписи для наблюдений за организмами и экспозицией в термостате. Для выделения и очистки культур из природных проб использованы современные прецизионные микроманипуляторы и микропипетки, среды для культивирования (Пратта и др.). Для культивирования эукариотрофных протистов в качестве жертв будут использованы бактерио-детритотрофные виды (преимущественно кинетопластиды и страменопилы из коллекции свободноживущих простейших группы протозоологии ИБВВ РАН), которые в свою очередь будут выращиваться с добавлением бактерий Pseudomonas flourescens Migula, 1895 в качестве пищевого объекта (ранее обосновано и успешно внедрено нами: Mylnikov, Tikhonenkov 2007, Zoosyst. Rossica 19; Мыльников, Тихоненков 2009, Зоол. Журн. 88; Tikhonenkov et al. 2014, PLoS ONE 9).
МИКРОСКОПИЯ
-Фазово- и интерференционно-контрастная световая микроскопия для изучения деталей внешнего строения и биологии клеток.
- Создание видеофильмов живых культур для исследования биологии, жизненного цикла и морфологии клеток с помощью прямой цифровой записи и компьютерным анализом или в режиме S-VHS с последующей оцифровкой изображений и сохранением фрагментов видеофильма в виде файлов формата AVI (Tikhonenkov et al. 2006, Eur. J. Protistol. 42; Tikhonenkov 2007/2008, Protistology 5).
-Методы приготовления постоянных препаратов (фиксация клеток на покровных стеклах в парах водного раствора четырехокиси осмия или насыщенным водным раствором сулемы с последующей промывкой в этаноле и спиртовом растворе йодида калия) (Мыльников, Тихоненков, Симдянов 2006, Зоол. Журн. 85).
-Методы пробоподготовки для проведения исследований ультраструктуры клеток, модифицированные нами с учетом особенностей фиксации легко деформируемых клеток гетеротрофных жгутиконосцев: сгущение клеток осаждением в центрифуге и фиксация в смеси 2%-ной четырехокиси осмия и 0,6%-ного глутаральдегида, приготовленной на 0,05 М какодилатном буфере (Мыльников 1994, Биол. Внутр. Вод 94) с последующим после дегидратации в серии спиртов и безводного ацетона помещением объекта в смесь смол Аралдита и Эпона) (Мыльников, Тихоненков 2009, Зоол. Журн. 88).
-Ультрамикротомирование для получения сверхтонких срезов клеток, исследуемых в трансмиссионном электронном микроскопе.
-Приготовление тотальных препаратов клеток для электронной микроскопии в соответствии с методикой Меструпа и Томсена (Moestrup, Thomsen, 1980 Handbook of Phycological Methods. Cambridge).
-Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия для изучения строения покровов клеток, жгутикового аппарата, клеточных органелл, включая экструсомы.
- Импрегнация кинетома инфузорий протеинатом серебра (Foissner, 1991), прижизненные наблюдения инфузорий с использованием фазового и интерференционного контраста.
- Исследование ультратонких морфологических структур (наноструктур) раковинных амеб методами сканирующей электронной микроскопии и фазового контраста (световая микроскопия).
- Оригинальные методы пробоподготовки препаратов солнечников для сканирующей электронной микроскопии (отсадка пипеткой Пастера живых клеток солнечников на поверхность обезжиренного покровного стекла, высушивание клеток на воздухе, отмывка клеток дистиллированной водой и вновь высушивание). Проведение СЭМ после дополнительного напыления препаратов сплавом золота и палладия.
2) Экспериментальные методы молекулярной биологии.
-Выделение ДНК из клональных культур одноклеточных эукариот с использованием центрифугирования, термостатирования, гомогенизации, ферментов для разрушения клеточных стенок и депротеинизации, реагентов для очистки ДНК.
-Амплификация фрагментов ДНК с использованием коллекции олигонуклеотидных праймеров, термостабильных ДНК-полимераз с различными свойствами для проведения полимеразной цепной реакции.
-Клонирование фрагментов ДНК и анализ рекомбинантных клонов с использованием бактериальных штаммов и векторов для клонирования, питательных сред и реагентов для селекции.
-Анализ фрагментов нуклеиновых кислот с использованием электрофоретического оборудования.
-Определение первичной структуры фрагментов ДНК (секвенирование) с использованием генетического капиллярного анализатора-секвенатора.
3) Методы биоинформатики и филогенетики.
-Обработка результатов капиллярного секвенирования: оценка качества, фильтрация ридов, подготовка данных для сборки.
-Сборка и аннотация данных секвенирования (Phred-Phrap-Consed package, Trinityv.R2012-06-08, Velvet, MIRA, Ray, SOAP).
-Компьютерный анализ публичных аннотированных и неаннотированных электронных баз данных GenBank, EST, Trace, EGO, TIGR.
-Проведение множественного выравнивания (MUSCLE, MAFFT, CLUSTAL), выявление ортологов, определение консервативных областей генов (Trimal, Gblocks).
-Филогенетический анализ (реконструкция методами наибольшего правдоподобия и Байеса) с использованием пакетов программ PAUP, RAxML, Treefinder, MrBayes, Phylobayes, Geneious и средств визуализации готовых деревьев SeaView, TreeView, FigTree, MEGA.
-Устранение артефактов притяжения длинных ветвей, исследование роли таксономической выборки.
-Тестирование альтернативной топологии (CONSEL).

4) Методы биогеографии и статистики.
- Сведение, селекция и унификация результатов частных исследований по пространственному распределению организмов в различных географических районах и создание баз данных.
- Различные варианты мета-анализа экологических данных: стандартизация результатов частных исследований и статистическая обработка массива информации, в котором в качестве первичных данных выступают результаты, полученные из разных источников (Gurevitch, Hedges 1993, 1999; Rosenberg et al. 2000).

5) Методы информатики и Web-дизайн.
- Создание интерактивных программ для идентификации протистов по типу диалога с исследователем на основе дихотомически ветвящихся алгоритмов с применением среды Borland С++ Builder Enterprise Suite.
- Имитационное моделирование, системный анализ, методы формализованного представления систем, исследование информационных потоков.
- Разработка web-системы осуществляется с использованием языка PHP и среды разработки Eclipse PDT. Для реализации базы данных протистов выбрана реляционная СУБД NoSQL. Для конечной реализации полученной структуры данных в СУБД проводится физическое проектирование, предусмотренное NoSQL. Проектирование базы данных проводится с помощью CASE-средства ERWin. Функциональное проектирование web-системы осуществляется с помощью CASE-средства BPWin 4.0.